无信号的典型表现
阳性对照孔和标准曲线都没有信号，但空白孔正常。这种情况提示问题出在检测体系而非样品本身。
试剂问题排查
抗体失效
酶标记抗体活性下降是最常见原因。检查抗体的有效期、保存条件和复溶情况。必要时做预实验验证抗体活性：用已知阳性样本测试。
底物失效
TMB 底物过期或保存不当会失去活性。底物应避光保存于 2-8°C，使用前恢复至室温。显色时如孔内无蓝色出现，提示底物可能失效。
酶活性被抑制
叠氮钠是常用的防腐剂，但它也会抑制 HRP 活性。确保缓冲液和封闭液不含叠氮钠。
操作问题排查
洗板不充分
过多的洗涤液残留会稀释加入的抗体或底物，导致信号减弱甚至没有信号。洗涤后可在吸水纸上拍干板子。
样品加入错误
确认样品加入到正确的孔中。加样时保持移液器垂直，避免挂壁导致样品损失。
孵育条件不当
温度或时间不符合要求都会影响反应效率。严格按照试剂盒说明操作，注意孵育温度和时间的一致性。
样品问题排查
样品中目标物浓度低于检测限
样品被过度稀释或本身含量低会导致信号低于检测限。尝试减少稀释倍数或浓缩样品。
样品降解或失活
样品采集、保存或处理不当可能导致目标蛋白降解。检查样品的采集条件和保存时间。
验证步骤
用试剂盒提供的阳性对照做验证。如果阳性对照有信号，说明试剂盒本身没问题，问题可能在样品处理环节。如果阳性对照也无信号，优先更换抗体和底物。
本文用于科研实验排查与条件优化，不替代实验室 SOP、试剂说明书或医学判断。